A técnica de Western blot foi utilizada para demonstrar a presença de anticorpos do soro de cães, que apresentavam leishmaniose visceral canina, contra algumas moléculas específicas no lisado da forma promastigota de Leshmania chagasi.Através da associação da técnica de Western blot com as alterações morfológicas observadas como resultado da técnica de soro-neutralização em células McCoy (que mimetizam o macrófago) foi possível observar o papel de algumas moléculas de maior relevância para a determinação da doença em cães sintomáticos bem como o papel de outras moléculas na predição de cães infectados assintomáticos com o potencial de serem transmissores e ainda diferenciá-los como cães assintomáticos resistentes. Na análise dos soros durante a reação de immunoblotting observou-se uma variação de 9 a 27 bandas imunorreagentes, que foram comparadas utilizando-se o coeficiente de similaridade de Dice. No dendrograma construído com base no coeficiente, observou-se 50% de similaridade entre as bandas totais reagentes com o lisado de promastigota formando cinco agrupamentos. A principal diferença foi observada com respeito à condição clínica, ou seja, cães sintomáticos e assintomáticos ficaram em grupos separados. Os soros dos cães assintomáticos distribuídos em dois grupos diferentes do dendrograma apresentaram padrões de comportamento diferentes, quanto à morfologia celular na reação de soro-neutralização, ou seja, a presença ou ausência de lise celular. De acordo com esta análise foi possível avaliar o status imunitário e associá-lo com determinados marcadores específicos observados na reação encontrada nas fitas de Western blot.

The Western blot technique was used to demonstrate the presence of antibodies in the blood of dogs that presented canine visceral leishmaniasis. This technique was used against some specific molecules present in the lysate of the promastigote form of Leshmania chagasi.Through the association of the results of the Western blot technique with the morphological alterations seen as a result of the serum neutralization technique performed in McCoy cells (which mimetizes the macrophage) it was possible to observe the role of some molecules of great relevance in determining the disease in symptomatic dogs as well as that of some other molecules associated with asymptomatic infected dogs that may become transmitters as well as differentiating them as asymptomatic resistant dogs. In the sera analyses carried out during the immunobloting a variation of 9 to 27 immunoreacting bands was observed, which were then compared using Dice's similarity coefficient. In the dendrogram constructed on the basis of the coefficient, 50% similarity was observed among the total number of reagent bands with the promastigote lysate, thus creating five groups. The main difference observed related to the clinical condition of the dogs: symptomatic and asymptomatic dogs were found in separate groups. The asymptomatic group of dogs was distributed in two different places in the dendrogram because they presented two different behavior patterns regarding the cellular morphology in the serum neutralization reaction: the presence or absence of cellular lysis. According to this analysis it is possible to evaluate the immune status and associate it with specific markers observed in the reaction found in the Western blot strips.

Cinéticas de crescimento de Leishmania realizadas in vitro após a internalização da forma promastigota na célula e a ocorrência da transformação do parasito na forma amastigota foram descritas por vários autores, seja com a utilização de explantes de macrófagos em células de baço de hamster ou atualmente da célula de linhagem de macrófago humano U937. Aliando a microscopia à descrição das inter-relações morfológicas e à síntese de moléculas específicas foi possível esclarecer pontos sobre a biologia do parasito. O presente estudo mostra o acompanhamento do ciclo de crescimento da Leishmania chagasi em uma cinética realizada com células de linhagem McCoy, no período de 144 horas. Durante o processo, as transformações morfológicas foram reveladas pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e as moléculas liberadas no meio extracelular foram observadas pelo método de SDS-PAGE, em intervalos de 24 horas no período de 144 horas. Observou-se que nas primeiras 72 horas, a forma promastigota da L. chagasi fica aderida à membrana das células com aspecto arredondado (amastigota-like). Em 96 horas as células infectadas apresentaram alterações morfológicas; em 120 horas, as células liberaram, para o meio extracelular, antígenos fluorescentes solúveis; e em 144 horas foram observadas novas formas alongadas dos parasitos como se fossem promastigotas. No SDS-PAGE, proteínas com pesos moleculares específicos são observadas em cada ponto da cinética, mostrando que a célula McCoy parece mimetizar o macrófago e que pode ser um modelo útil para o estudo da infecção do binômio leishmânia/célula.

The kinetics of growth of Leishmania performed in vitro after internalization of the promastigote form in the cell and the occurrence of the transformation of the parasite into the amastigote form have been described by several authors. They used explants of macrophages in hamster spleen cell culture or in a human macrophage lineage cell, the U937. Using microscopy, the description of morphologic inter-relationship and the analysis of the production of specific molecules, it has been possible to define some of the peculiarities of the biology of the parasite. The present study shows the growth cycle of Leishmania chagasi during the observation of kinetic analysis undertaken with a McCoy cell lineage that lasted for a period of 144 hours. During the process, the morphologic transformation was revealed by indirect immunofluorescence (IF) and the molecules liberated in the extra cellular medium were observed by SDS-PAGE at 24-hour intervals during the whole 144-hour period. It was observed that in the first 72 hours the promastigote form of L. chagasi adhered to the cell membranes and assumed a rounded (amastigote-like) form. At 96 hours the infected cells showed morphologic alterations; at 120 hours the cells had liberated soluble fluorescent antigens into the extra cellular medium. At 144 hours, new elongated forms of the parasites, similar to promastigotes, were observed. In the SDS-PAGE, specific molecular weight proteins were observed at each point of the kinetic analysis showing that the McCoy cell imitates the macrophage and may be considered a useful model for the study of the infection of the Leishmania/cell binomial.

Recentes estudos demonstraram o uso do vírus raiva como modelo vetor para produzir vacinas expressando as glicoproteínas do vírus HIV-1. A homologia na seqüência entre gp120 do vírus HIV-1 e a glicoproteína G do vírus rábico já foi previamente relatada. Devido a estes fatos a linhagem de célula McCoy utilizada com sucesso para a replicação do vírus rábico foi utilizada para demonstrar a replicação do HIV-1. Amostra de HIV-1 foi isolada de plasma de um paciente soro positivo e inoculada em células de linhagem McCoy e então a infecção viral foi estudada em passagens sucessivas do vírus nesta célula. As proteínas liberadas no meio extra celular foram analisadas quanto a atividade biológica pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida e imunotransferência em membrana de nitro-celulose reagindo com soros positivos para HIV-1 e soros de pacientes negativos. As passagens sucessivas do HIV-1 em células demonstraram a replicação viral, o aumento da permeabilidade da membrana citoplasmática, a formação de sinsício e lise celular. Análises com citometria de fluxo mostraram com clara evidência a presença de receptores CD4+ o que possivelmente deve ser a causa que possibilita a facilidade do isolamento e replicação do vírus HIV-1 nesta célula. Concluindo os resultados observados permitem utilizar esta linhagem celular como um possível modelo para isolamentos de HIV, bem como realizar estudos da dinâmica de infecção viral em diversas situações inclusive de exposição a drogas em estudos farmacológicos, e talvez estudos e análises da resposta imune em terapias vacinais.

Several studies have recently shown the use of recombinant rabies virus as potential vector-viral vaccine for HIV-1. The sequence homology between gp 120 and rabies virus glycoprotein has been reported. The McCoy cell line has therefore been used to show CD4+ or CD4+ like receptors. Samples of HIV-1 were isolated, when plasma of HIV-1 positive patients was inoculated in the McCoy cell line. The virus infection was then studied during successive virus passages. The proteins released in the extra cellular medium were checked for protein activity, by exposure to SDS Electrophoresis and blotting to nitro-cellulose filter, then reacting with sera of HIV positive and negative patients. Successive passages were performed, and showed viral replication, membrane permeabilization, the syncytium formation, and the cellular lysis (cytopathic effect). Flow cytometry analysis shows clear evidence that CD4+ receptors are present in this cell line, which enhances the likelihood of easy isolation and replication of HIV. The results observed allow the use of this cell line as a possible model for isolating HIV, as well as for carrying out studies of the dynamics of viral infection in several situations, including exposure to drugs in pharmacological studies, and possibly studies and analyses of the immune response in vaccine therapies.

Considerando o impacto na saúde pública gerado pela ocorrência da cisticercose, especialmente a forma neurológica, neurocisticercose (NC), foi estudada a freqüência de positividade de anticorpos anti-cisticerco em amostras de soro de 1.863 habitantes do município de Cássia dos Coqueiros, SP, situado a 80 Km de Ribeirão Preto, região considerada endêmica para a cisticercose. As amostras foram avaliadas pelo teste ELISA usando extrato antigênico de líquido vesicular de Taenia crassiceps (Tcra) e as amostras reagentes e inconclusivas foram analisadas pelo imunoblot. Das 459 amostras submetidas ao imunoblot, 40 foram fortemente imunorreativas para os peptídeos imuno dominantes de 18 e 14kD. Considerando o uso do teste imunoblot como confirmatório, dada sua elevada especificidade, a soroprevalência de anticorpos anti-cisticerco foi de 2,1% na população estudada.

Considering the impact of cysticercosis on public health, especially the neurologic form of the disease, neurocysticercosis (NC), we studied the frequency of positivity of anti-Taenia solium cysticercus antibodies in serum samples from 1,863 inhabitants of Cássia dos Coqueiros, SP, a municipal district located 80 km from Ribeirão Preto, an area considered endemic for cysticercosis. The 1,863 samples were tested by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) using an antigenic extract from Taenia crassiceps vesicular fluid (Tcra). The reactive and inconclusive ELISA samples were tested by immunoblotting. Of the 459 samples submitted to immunoblotting, 40 were strongly immunoreactive to the immunodominant 18 and 14 kD peptides. Considering the use of immunoblotting as confirmatory due to its high specificity, the anti-cysticercus serum prevalence in this population was 2.1%.

É descrita a produção de potenciais anticorpos monoclonais (MoAbs) usando camundongos BALB/c imunizados com antígenos de líquido vesicular de T. crassiceps (VF-Tcra). O soro imune apresentou anticorpos IgM e IgG anti-VF-Tcra para os peptídeos <20kDa, e com reatividade cruzada com peptídeos 8-12, 14 e 18kDa de T. solium (Tso). Após a fusão, foram selecionados 33 clones IgM com reatividade anti-Tcra e anti-Tso e 53 clones IgG com reatividade específica, sendo que destes, 5 apresentaram reatividade cruzada com antígeno de Tso. Dois clones identificaram os peptídeos 8-14 e 18kDa de VF-Tcra.

We describe the production of the potential monoclonal antibodies (MoAbs) using BALB/c mice immunized with vesicular fluid (VF)-Tcra (T. crassiceps) antigen. Immune sera presented anti-VF-Tcra (<20kD) IgG and IgM antibodies with cross-reactivity with T. solium (Tso) antigen (8-12, 14, and 18 kD). After cell fusion, we selected 33 anti-Tcra and anti-Tso reactive IgM-clones and 53 anti-Tcra specific IgG-clones, 5 of them also recognizing Tso antigens. Two clones identified the 8-14 and 18kD peptides of VF-Tcra.

The high sensitivity and the possibility of automation of the enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELISA) has indicated this technique as one of the most useful serological test for epidemiological studies. In the present study, an ELISA for detection of IgG antibodies against adult worm antigens (IgG-ELISA) was investigated for epidemiological purposes, in a rural area of the municipality of Itariri (São Paulo, Brazil). Blood on filter paper (1,180 samples) from about 650 schoolchildren were submitted to ELISA and the data compared to the results of the parasitological method of Kato-Katz and also to the IgM-IFT (immunofluorescence test for IgM antibodies to gut associated antigens). The prevalence rates respectively of 8.5%, 43.0%, and 56.2% by the Kato-Katz, IgG-ELISA, and IgM-IFT methods suggest the poor sensitivity of the parasitological method for detection of Schistosoma mansoni eggs in individuals with low worm burden, situation commonly observed in low endemic areas. These results can partially explain the poor degree of agreement between the IgG-ELISA and the Kato-Katz, as suggested by the Kappa index of 0.170. Otherwise, the Kappa index of 0.675 showed substantial agreement between the two serological tests. Some discrepancy of results between the two serological techniques must be better investigated.

Foi padronizado o teste de hemaglutinação (HA) utilizando hemácias formolizadas e taninizadas de ganso sensibilizadas com extrato salino total de C. cellulosae (HA-Cc) e líquido vesicular de Cysticercus longicollis (HA-Cl). Foram ensaiadas 61 amostras de líquido cefalorraquiano (LCR), 41 de pacientes com neurocisticercose e 20 de um grupo controle, respectivamente, reagentes e não-reagentes no teste ELISA utilizando antígenos de C. cellulosae. As amostras do grupo controle foram não-reagentes e 35 (85,4%) e 34 (82,9%) LCR dos pacientes foram reativos nos testes HA-Cc e HA-Cl, respectivamente. O reagente de hemácias sensibilizadas prontas para uso, foi estável por até 6 meses quando armazenado a 4°C em solução estabilizante com 50% de glicerol. Os resultados confirmam que o reagente de HA-Cl pode ser empregado como alternativa no diagnóstico imunológico da neurocisticercose

A hemagglutination (HA) test was standardized using formalin- and tannin-treated gander red blood cells sensitized with a total salt extract of C. cellulosae (HA-Cc) and an antigenic extract of Cysticercus longicollis (HA-Cl) vesicular fluid. A total of 61 cerebrospinal fluid (CSF) samples were assayed, 41 from patients with neurocysticercosis and 20 from a control group, which were, respectively, reactive and non-reactive to ELISA using C. cellulosae. The CSF samples from the control group did not react and 35 (85.4%) and 34 (82.9%) CSF samples from patients were reactive to the HA-Cc and HA-Cl tests, respectively. The reagents ready for use were stable up to 6 months when stored at 4°C in 50% glycerol. The present results confirm that the reagent using Cysticercus longicollis stabilized with glycerol can be used as an alternative in the immunological diagnosis of neurocysticercosis